أصبحت أجهزة الطيف الضوئي أدوات روتينية في مختبرات البيولوجيا الجزيئية الحديثة. كثيرا ما تستخدم للحمض النووي ، الكمي البروتين وكمية تركيزات نمو البكتيريا.
مبدأ بسيط من الطيف
يستخدم مقياس الطيف الضوئي مصدر ضوء يمكنه توليد أطوال موجية متعددة ، ويمر عبر سلسلة من الأجهزة الطيفية لإنشاء مصدر ضوء لطول موجة محدد. بعد مرور مصدر الضوء خلال العينة المراد اختبارها ، يتم امتصاص جزء من مصدر الضوء ، ويتم حساب امتصاص العينة ، وبالتالي يتحول إلى تركيز العينة. . امتصاص العينة يتناسب مع تركيز العينة.
الكمي للأحماض النووية
الكمي للأحماض النووية هي الوظيفة الأكثر استخداما من الطيف. يمكن قياس كمية قليلة النوكليوتيدات ، الحمض النووي المفرد المزدوج ، والحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي في المخزن المؤقت. ذروة امتصاص أعلى قمة امتصاص الحمض النووي هي 260 نانومتر. يختلف التركيب الجزيئي لكل حمض نووي ، لذلك تختلف عوامل التحويل. لتحديد أنواع مختلفة من الأحماض النووية ، حدد المعاملات المقابلة مقدما. على سبيل المثال ، تمتص امتصاص OD 1 إلى 50 ميكروغرام / مل من dsDNA ، 37 ميكروغرام / مل من ssDNA ، 40 ميكروغرام / مل من RNA ، و 30 ميكروغرام / مل من Olig. يتم تحويل الامتصاصية بعد الاختبار بواسطة المعاملات أعلاه للحصول على تركيز العينة المقابل. قبل الاختبار ، حدد الإجراء الصحيح ، وأدخل حجم محلول المخزون وتخفيفه ، ثم اختبر الحل الفارغ والعينة. ومع ذلك ، لم تكن التجربة سلسة دائمًا. قد تكون القراءات غير المستقرة أكبر صداع للمجرب. الأدوات ذات الحساسية العالية تظهر انجرافًا أكبر في الامتصاص.
في الواقع ، يسمح مبدأ التصميم ومبدأ العمل في مقياس الطيف الضوئي بامتصاص الامتصاص داخل نطاق معين ، أي أن للأداة دقة ودقة معينة. على سبيل المثال ، تبلغ دقة مقياس Eppendorf Biophotometer ≤1.0٪ (1A). تختلف نتائج هذه الاختبارات المتعددة بين حوالي 1.0٪ من المتوسط وهي طبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري أيضًا النظر في الخواص الفيزيائية والكيميائية للحمض النووي نفسه ودرجة الحموضة في المخزن المؤقت الذي يذوب فيه الحمض النووي ، وتركيز الأيون ، إلخ: عندما يكون تركيز أيون مرتفعًا جدًا أثناء الاختبار ، يكون نوبات القراءة ، لذلك يوصى باستخدام قيمة معينة من الأس الهيدروجيني وتركيز أيوني منخفض. تعمل المخازن المؤقتة ، مثل TE ، على تثبيت القراءات بشكل كبير. تركيز التخفيف للعينة هو أيضًا عامل لا يمكن تجاهله: نظرًا للوجود الحتمي لبعض الجسيمات الدقيقة ، وخاصة عينات الحمض النووي ، في العينة. وجود هذه الجزيئات الصغيرة يتداخل مع نتائج الاختبار. من أجل تقليل تأثير الجزيئات على نتائج الاختبار ، يجب أن يكون امتصاص الحمض النووي أكبر من 0.1 A على الأقل ، ويفضل أن يكون الامتصاص بين 0.1 و 1.5 A. ضمن هذا النطاق ، تدخل الجزيئات صغيرة نسبيا والنتيجة مستقرة.
هذا يعني أن تركيز العينة يجب ألا يكون منخفضًا جدًا أو مرتفعًا جدًا (يتجاوز نطاق اختبار مقياس الضوء). أخيرًا ، يجب أن تكون عوامل التشغيل ، مثل الخلط كافية ، وإلا فإن قيمة الامتصاص منخفضة جدًا ، بل وحتى القيم السلبية ؛ لا يمكن أن يوجد الخليط وفقاعات ، ولا يوجد للسائل الفارغ أي تعليق ، وإلا فإن القراءة تنجرف بشكل كبير ؛ يجب استخدام نفس الكوفيت لاختبار الفراغ والعينة ، وإلا فإن الفرق في التركيز كبير جدًا ؛ يتم تحديد عامل التحويل ووحدة تركيز العينة باستمرار ؛ لا يمكن استخدام كفيت مع نافذة ارتداء ؛ يجب أن يصل حجم العينة إلى الحد الأدنى للحجم المطلوب من قبل كوفيت.
بالإضافة إلى تركيز الحمض النووي ، يُظهر مقياس الطيف الضوئي أيضًا عدة نسب مهمة جدًا تشير إلى نقاء العينة ، مثل نسبة A 260 / A 280 ، المستخدمة لتقييم نقاء العينة لأن ذروة امتصاص البروتين هي 280 نانومتر عينة نقية مع نسبة أكبر من 1.8 (الحمض النووي) أو 2.0 (الحمض النووي الريبي). إذا كانت النسبة أقل من 1.8 أو 2.0 ، فإنها تشير إلى وجود البروتين أو المواد الفينولية. تشير المادة 230 إلى وجود بعض الملوثات في العينة ، مثل الكربوهيدرات والببتيدات والفينولات وما إلى ذلك ، ونسبة الحمض النووي النقي أكثر 260 / A 230 أكبر من 2.0. A 320 يكتشف تعكر الحل وعوامل التداخل الأخرى. بالنسبة للعينات النقية ، A 320 هو عموما 0.
هانغتشو سومر الصك المحدودة
Add: No.168 Wuchang Ave.، Yuhang District، Hangzhou 310023، China
هاتف: + 86-571-88739859
هاتف: +8618658504900
البريد الإلكتروني: info@sumerlab.com
الويب: sumerinstrument.com